استفاده در نظر گرفته شده: عفونیویروس رینوتراکئیت گاویکیت تشخیص آنتی بادی الایزا برایتشخیص رینوتراکئیت عفونیآنتی بادی های ویروس در سرم گاو در شرایط آزمایشگاهی
نمونه: سرم
مواد ارائه شده:
روش های آزمون و تفسیر
مرحله 1 روش آزمایش
1.1 آماده سازی محلول شستشو
Wغلظت orking wمایع خاکستر:قبل از استفاده، محلول شستشو باید به دمای اتاق (20-25 درجه) برگردد و به طور یکنواخت تکان داده شود تا یکنواخت شود. سپس 20 برابر محلول شستشو غلیظ را با آب تصفیه شده رقیق کنید (مثلاً 5 میلی لیتر محلول غلیظ شستشو را به 95 میلی لیتر آب تصفیه شده اضافه می کنند) خوب مخلوط کنید و مایع شستشوی رقیق شده را می توان در دمای 8-2 درجه به مدت 7 روز نگهداری کرد.
1.2 آماده سازی نمونه
① خون کامل حیوان گرفته شد، با سرعت 4000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و مایع رویی جمع آوری شد. سرم همچنین می تواند به طور طبیعی بدون همولیز منعقد شود.
② سرم مورد آزمایش را 50 بار در صفحه رقیق سازی سرم رقیق کنید (به عنوان مثال: 3 لیتر از سرم مورد آزمایش را به رقیق کننده نمونه 147 لیتری اضافه کنید).
توجه: کنترل های منفی و مثبت نیازی به رقیق شدن ندارند
1.3 روش تست
① برچسب آنزیمی Microplate را بردارید (با توجه به تعداد نمونه ها، می توان چندین بار از هم جدا شده و استفاده کرد)، 100 لیتر از سرم رقیق شده را به برچسب آنزیمی Microplate اضافه کنید، هر کدام را دو چاه برای کنترل منفی و کنترل مثبت قرار دهید و به ترتیب 100 ul به چاه واکنش اضافه کنید. نمونه را به آرامی در چاه تکان دهید، با استفاده از فیلم صفحه آب بندی برای پوشش صفحه، و در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید.
②فیلم صفحه آب بند را باز کنید، محلول داخل صفحه را به خوبی تکان دهید، 300 میکرولیتر مایع شستشو با غلظت کارکرد را به هر چاه اضافه کنید و سپس مایع را در چاه دور بریزید. مراحل بالا را 5 بار تکرار کنید و در نهایت روی یک کاغذ جاذب تمیز خشک کنید.
③کونژوگه آنزیمی رقیق شده: آنزیم مزدوج (80×) را 80 بار رقیق کنید (به عنوان مثال: 10 ul conjugate enzyme + 790ul رقیق کننده نمونه، مقدار خاص مورد نیاز با توجه به تعداد نمونه های آزمایشی محاسبه می شود)، خوب مخلوط کنید و کنار بگذارید.
④100 میکرولیتر آنزیم کونژوگه را به هر چاهک اضافه کنید، روی صفحه را بپوشانید و در دمای 37 درجه به مدت 30 دقیقه انکوبه کنید.
⑤شستن صفحه آنزیم، عملیات خاص مانند موارد فوق ② است.
⑥100 میکرولیتر محلول بستر را به هر چاهک اضافه کنید، روی صفحه را بپوشانید و به مدت 10 دقیقه در دمای 37 درجه دور از نور انکوبه کنید.
مرحله 2 تفسیر نتیجه
مقدار OD450 هر چاهک روی میکروپلیت ریدر 96 چاهی خوانده شد.
2.1 اعتبار سنجی میانگین مقدار OD450nm کنترل منفی کمتر از 0.25 بود و میانگین مقدار OD450nm کنترل مثبت بزرگتر یا مساوی 0.6 بود، نتایج تجربی معتبر بودند. در غیر این صورت، آزمایش باید تکرار شود.
2.2 روش محاسبه
برای هر نمونه، S/P را به صورت زیر با استفاده از نمونه اصلاح شده و مقادیر کنترل محاسبه کنید:
2.3 تفسیر نتایج
وقتی S/P < 0.2 باشد، منفی ارزیابی می شود.
وقتی S/P > 0.3 باشد، مثبت ارزیابی می شود.
وقتی 0.2 کمتر یا مساوی S/P کمتر یا مساوی 0.3 باشد مشکوک ارزیابی می شود و پیشنهاد می شود یک هفته بعد نمونه برداری و آزمایش تکرار شود.
